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通讯作者单位：印度科学学院
DOI号：10.1016/j.soilbio.2023.109225
实验设计
结果
1 微生物群落和功能
将7650894条reads聚类为47个已知细菌门的1937个独特OTUs。其中，鉴定到属水平的OTUs仅有924个。放线菌门、酸杆菌门、浮霉菌门、变形菌门和疣微菌门最为常见(图1，图S2)。每个样本OTUs物种丰富度在494至866之间(平均713±80 SD，图2)。Shannon多样性在3.72至5.06之间(4.49±0.21，图2)，而Simpson多样性在0.908至0.985之间(0.969±0.011，图2)。同样，功能丰富度(即代谢底物的数量)范围在6到30之间(平均21±7 SD，图1，图S2)。
图1.在有/没有大型哺乳食草动物的情况下，所有地块和整个生长季节(早、中、晚)的微生物分类谱(a, 门水平)和微生物功能谱(b，n = 30个底物)。每个单元格的面积分别与每个门的总丰度和每种底物的分解代谢活性成正比。数字表示相对丰度(分类)和相对微生物活性(功能)的百分比。
2 季节性和食草动物对微生物种类和功能的影响
物种(OTUs)丰富度的变化既不能通过季节来解释(图2a；F2,45=0.02，P=0.98)，也不能通过放牧来解释(图2a；F1,45=1.61，P=0.21)。Shannon多样性随放牧而变化(图2b; F1,45 = 7.56, P = 0.01)，但不随季节而变化(图2b; F2,45 = 0.03, P = 0.97)。Simpson多样性不随季节而变化(图2c; F2,45 = 0.60, P = 0.56)，也不随放牧而变化(图2c; F1,45 = 2.30, P = 0.13)。微生物功能丰富度随季节而变化(图2b；F2,45=38.96，P1,45=0.01，P=0.098)。同样，微生物功能分散度随季节变化(图2c；F2,45=48.89，P1,45=0.01，P=0.092)。PCoA分析显示，微生物物种组成随季节而变化(图3；F2,54=4.70，P=0.001)，但与放牧没有关(图3；F1,54=1.33，P=0.21)。功能组成也随季节变化(图3，F2,54=4.83，P=0.001)，但与放牧没有关(图3：F1,54=0.87，P=0.55)。
图2.在整个生长季节有/没有大型哺乳食草动物的情况下，土壤微生物的物种丰富度(a)、Shannon多样性(b)、Simpson多样性(c)，功能丰富度(d)和功能分散度(e)。物种丰富度在放牧地和未放牧地之间以及生长季节之间没有显著差异。功能丰富度和功能分散度在放牧地和未放牧地之间没有差异，但在生长季节之间存在差异。
图3.主坐标分析(PCoA)显示在有/没有大型哺乳食草动物的情况下以及生长季节不同时间点微生物群落和分解者功能的排序。总体而言，土壤微生物分解者的分类和功能组成在放牧地和未放牧地之间没有变化，但在生长季节之间存在差异。
3 物种组成和功能之间的关系
微生物功能Kriged图表明，群落组成差异与功能差异有关(图4)，并使用dbSEM进一步评估(图5)。总体而言，dbSEM的功能丰富度和功能分散度(图5)表明数据与假设路径吻合良好(SRMR=0.005，RMSEA0.999，X2=1.34，P-value(X2)=0.512)。路径系数表明，物种组成与功能丰富度呈正相关(物种组成→功能丰富度；路径系数=0.08，P=0.06；图5)，但不含功能组成(物种组成→功能组成；P > 0.10；图5)。物种丰富度对功能丰富度和功能组成均没有直接或间接影响(P>0.10；图5)，土壤质地对物种组成有正向影响(质地→物种组成；路径系数=0.09，P=0.001；图5)。季节性与物种组成(季节→物种组成；路径系数=0.14，PPPP=0.08；图5)，因此随着季节从季初到季中到季末的发展，样品之间的物种丰富度趋于相似。由此可见，季节性对多样性-功能关系既有直接影响(季节→物种组成→功能)，也通过湿度(季节→湿度→物种组成→功能)间接影响。湿度的变化影响物种组成(湿度→物种组成；路径系数=0.12，P=0.02；图5)和物种丰富度(湿度→物种丰富度；路径系数=0.08，P=0.09；图5)。土壤pH值变化与物种丰富度呈负相关(pH→物种丰富度；路径系数=-0.07，P=0.09；图5)。放牧不直接影响这种关系(放牧→物种组成→功能)，也不通过土壤因子间接影响这种关系(放牧→土壤→物种组成→功能)。
通过对功能数据进行迭代重采样的思维实验，发现16种或更多不同组合的底物可以提供功能多样性的稳健解释(图6)。只要有16种或更多功能的定量信息，就可以推断出物种组成与功能之间的关系(图5)。
图4.Kriged图总结了微生物功能丰富度(a)和功能分散度(b)与微生物物种组成的关系，表明微生物分解者的功能可以随物种组成而变化。彩色区域强调了在生长季节不同时间点测量的研究地点的微生物物种组成范围内的微生物功能插值。物种组成用主坐标分析(PCoA)的第一轴和第二轴表示。圆圈表示物种组成的采样数据点。
图5.基于距离的结构方程模型(dbSEM)评估放牧、季节、土壤非生物特性对物种多样性与微生物功能关系的影响。数值表示标准化路径系数，星号表示统计学显著性(***P≤0.01, **P≤0.05, *P≤0.10)。放牧(放牧/未放牧)的模型路径不显著，因此未显示。模型诊断为SRMR=0.004，RMSEA0.999，X2=1.34，df=2，P-value(X2)=0.512。总体而言，微生物功能与物种组成呈正相关，而物种丰富度对功能没有影响。季节性通过土壤湿度的变化对这一关系有直接和间接影响。
图6.思维实验总结，评估测量功能的数量如何影响多样性-功能关系的解释(a)。通过对功能数据进行迭代重采样，生成了2800个子集，其中包含2-29个功能的100种不同的可能组合。对于每个子集，重复进行dbSEM分析(图5)，并检查了连接物种多样性(物种丰富度和物种组成)与功能(功能丰富度和功能组成)的路径的显著性(α=0.1)。报告了上述路径的P值(物种多样性→功能)。关于适应不同数量物种和功能的微生物多样性-功能关系的三类研究的概念总结(b)。对101个物种和101种功能的实验组装群落的研究，通常会遇到物种丰富度和功能之间的正相关关系(即①)。对103个物种的超多样化自然群落的研究，通常会遇到部分冗余(即②)。对大量假定功能进行宏基因组解释的研究也会遇到部分冗余(即③)。思维实验和概念总结进一步强调了微生物物种身份(而非物种数量)对理解土壤分解过程的重要性。
讨论
虽然生产者的多样性-功能关系以及它们在较高营养水平上受到消费者的调节是众所周知的，但对于微生物分解者和分解功能来说，它们仍然是不确定的。本文研究了微生物分类多样性是否与微生物分解功能相关，并发现了三个关键结果：(i)土壤微生物群落和功能随时间的变化比随空间的变化更大(图1-3)；(ii)微生物物种组成影响功能丰富度，但不影响功能组成(图4-5，图S4)。(iii)与土壤背景变量和季节性不同，大型哺乳食草动物不会影响微生物的多样性-功能关系(图5)。此外，覆盖一系列分解者代谢过程的一小部分功能(16种或更多与碳代谢相关的底物)提供了足够的样本量来理解土壤微生物的多样性-功能关系(图6)。
本研究发现，微生物群落结构和功能的时间变化比空间异质性更为明显(图2，3，5)。这与其他研究一致，即资源可用性的时间波动解释了为什么微生物对时间变量的响应大于对空间变量的响应。研究地点微生物资源可用性的时间波动可能源于短生长季节植被生长的单峰模式。此外，本研究发现土壤湿度和质地对分解者多样性-功能关系的影响是一致的(图5)。湿度和质地可以在栖息地过滤中发挥重要作用，因为它们通过分类组成促进功能(图5)，导致分解者之间功能冗余的丧失。虽然湿度和质地的影响(图5)与跨生态系统的其他研究一致，但与其他研究不同，本研究没有发现土壤pH值对这种关系的影响。这可能是由于采样点(空间)土壤pH值的相对不变性，但不同景观和生态系统之间的差异可能更大。
高度多样化的微生物群落结构和功能缺乏空间异质性会导致功能冗余。举个例子，本研究平均每个样本记录了700多个OTUs，在760万个reads中总共记录了1937个OTUs。因此，可以理解的是，数据没有显示物种丰富度和功能之间的关系(图S4)。例如，在每个样本的局部丰富度低于200 OTUs的地方，有证据表明存在耦合，因此缺乏冗余。但是，在每个样本700OTUs的情况下(图3-4)，微生物多样性可能与功能解耦。因此，毫不奇怪，不同的研究已经遇到了微生物物种丰富度和功能之间的耦合和解耦关系，本研究的数据强调了适应物种组成的重要性。
对于高度多样化的自然微生物群落，冗余的存在经常受到质疑。从严格意义上讲，功能冗余指的是，在一个群落中，存在执行重叠功能的生物体，它们可以在不改变功能的情况下很容易被取代。然而，在自然群落中很少出现这种情况，因为不同生物执行同一组功能的环境阈值(如温度、降水)可能不同。例如，本研究发现季节性和土壤因素(湿度和质地)对多样性-功能关系有很强的控制作用。此外，功能冗余的概念还取决于研究了哪些功能，以及有多少功能(图6)。一方面，在自然群落中，微生物可以同时执行多种功能，其中一些功能会被其他微生物共享，从而使功能冗余。另一方面，有些功能可能只针对少数几个特定的对象，这使得功能特化且不冗余。因此，本研究的结果不是完全冗余，而是部分冗余，其中一些功能可能由自然群落中的多个微生物执行，而不是全部。但是，由于1937个OTUs尚未被解析到属/种水平，我们并不完全了解负责高级功能的微生物的身份。然而，预期的技术进步可以弥补这种知识空白，从而更好地解释这一关系。
鉴于土壤微生物分类的分辨率较低，以往的研究往往依赖于宏基因组的解释和从各种蛋白质和酶的遗传密码的存在/缺失中推断假定的功能。这并不能保证在样本中实际执行相应的功能，因为“所有的东西都是没有处不在的，但环境选择不是”。本研究通过测量功能的大小来评估多样性-功能关系，尽管只有30个与碳化合物分解代谢相关的功能中的一小部分。但我们的思维实验表明，与宏基因组方法的103个假定功能相比，对101个功能的关系解释是可推广和可靠的。此外，微生物和分解的这种耦合的多样性-功能关系与生产者和生产的模式一致，其中物种的身份比物种的数量更重要。
本研究发现微生物多样性和功能之间的关系与大型哺乳食草动物的存在与否有关。这也符合生产者及其生产中的恢复力和抗性模式，即排除食草动物不会影响生产者的多样性和生产。然而，与消费者对生产者的直接影响相反，分解者的运作机制可能不同。可能存在多种相互依赖的路径来支持这种依赖性和抗性。首先，食草动物直接和间接影响的相对优势之间的平衡可以表现为对分解者多样性-功能关系没有净影响。其次，由于竞争-合作相互作用，微生物多样性和功能之间的紧密耦合可能在我们十年之久的食草动物排除实验开始之前就已经建立起来了。一旦建立，微生物分解者之间的相互作用可能经受住实验性的食草动物排除(抗性)，并/或从中迅速恢复(恢复力)。第三，食草动物对本研究中未量化的其他类型的分解者的影响可能不同，例如古菌和真核分解者。
总体而言，本研究发现微生物群落组成的差异会影响微生物功能多样性，而不影响生物物种丰富度。这与功能冗余的一个关键方面不一致，即假设物种多样性(丰富度和组成)与功能多样性之间没有关系。相反，本研究结果表明，微生物群落中某些物种(即组成)的减少或增加对微生物功能的影响比其他物种更大。因此，物种多样性缓冲(即抗性)和改善(恢复力)压力源效应的潜力取决于未受压力源影响的物种的身份。虽然微生物多样性-功能关系似乎对实验性移除大型哺乳食草动物具有抗性和/或恢复力，但它们对土壤湿度的变化很敏感，而土壤湿度是大多数旱地生态系统过程和服务功能的主要决定因素。未来的研究可以解决微生物功能的抗性和恢复力如何与全球变化的各个方面相吻合，包括降水量的年际变化及其年内再分配。旱地降水持续变化对土壤水分有效性的影响，特别是在跨喜马拉雅和中亚的高海拔旱地，可能会对其生态系统功能和服务的保护和可持续管理构成挑战。
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